Bioautografi

Bioautografi merupakan suatu metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, dan anti viral. Bioautografi juga merupakan suatu metode yang cepat untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui yang mana metode kimia atau fisika yang terbatas untuk substansi yang murni. Sementara deteksi kimia reaksi warna hanya spesifik digunakan sebagai pembanding hasil bioautografi sehingga kedua meode tersebut saling melengkapi ( Stahl, 1965 ).
Ada beberapa syarat yang harus dipenuhi sebelum melakukan uji bioautografi antara lain :
1.Sterilisasi alat dan proses pengerjaannya
2.Ada media yang cocok untuk menumbuhkan mikroba uji
3.Ada mikroba uji yang digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri senyawa uji
4.Senyawa yang akan dianalisis diduga memiliki aktivitas membunuh atau menghambat bakteri ( Wagmon & Wenstein, 1983 ).
Bioautografi dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut :
1.Plate Kromatografi hasil KLT diletakkan di atas permukaan media agar dalam petri yang telah dihokulasi bakteri yang sensitive terhadap antibiotik uji, kemudian diinkubasi 37˚C selama 15 – 20 jam.
2.Menggunakan kertas saring yang diletakkan di antara plat kromatografi dengan permukaan media berinkolum bakteri.
3.Menumbuhkan tetradium ke dalam lapisan media agar atau pada tempat tumbuh bakteri setelah diinkubasi dan didiamkan beberapa waktu. Zona hambat akan berwarna merah ( Zweig & Whitaker, 1971 ).
Ada 3 metode bioautografi :
•Bioautografi langsung / direct : mikroorganisme tumbuh secara langsung di atas lempeng KLT
•Bioautografi kontak / contact : senyawa dipindahkan dari lempeng KLT ke medium
•Bioautografi pencelupan / overlay : medium agar yang telah diinokulasikan dengan mikroorganisme dituang di atas lempeng KLT ( Mulyaningsih, 2004 )
Deteksi dari antibiotik yang dikembangkan diatas kromatogram menggunakan deteksi kimia sulit dilakukan karena secara kimiawi atibiotik sangat beraneka ragam. Dengan demikian dapat digunakan sebuah metode biologis untuk mendeteksi antibiotik, yang menempatkan kromatogram yang telah dikembangkan pada sebuah medium agar yang telah ditanami mikroorganisme uji yang sesuai. Antibiotik akan berdifusi dari kromatogram ke dalam agar nutrient. Setelah dilakukan inkubasi, zona jernih pada agar memiliki penghambatan dari pertumbuhan organisme uji menunjukkan posisi antibiotik pada kromatogram ( tyler et al, 1988 ).
Dalam prateknya, kromatogram diletakkan pada permukaan media agar di dalam petri dish yang telah diinokulasi selama 15 – 20 jam pada temperatur 37˚C akan tampak zona yang jernih pada lapisan tersebut dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme ( Zweig & Whitaker, 1971 ).
Diantara berbagai teknik kromatografi, Kromatografi Lapis Tipis adalah yang paling cocok untuk analisis metode ini hanya memerlukan waktu yang singkat untuk menyelesaikan analisis dan memerlukan jumlah cuplikan sedikit. Selain itu, kebutuhan ruang minimum dan penanganannya sederhana ( Stahl, 1985 ).